風濕科醫生會詢問病人的病徵、家族病史等，為他進行臨床檢查，檢驗他的背部、骨盆、骶髂關節、胸部及腳跟等的疼痛情況、脊椎的活動範圍及走路姿勢等；另外亦可能替他進以下的檢驗去幫助確診及排除其他疾病的可能性，包括：
X光檢驗：
主要是幫助確定關節的發炎跡象、受破壞程度及監測疾病的進展，不過在患病早期，由於關節可能未受破壞，X光不一定能夠幫助診斷，需要利用其他檢查去確診。
電腦斷層掃描(CT Scan)或磁力共振掃描(MRI)：
幫助檢查關節發炎及變形情況，有助發現早期的強直性脊椎炎。
血液檢驗：
紅血球沉降速率(ESR)及C反應蛋白檢驗：檢查病人的發炎程度，有助區別於機械性下背痛。如兩者的數字上升，顯示體內炎症活躍。
全血圖(CBC)：強直性脊椎炎有機會引致貧血，進行全血圖檢驗可以幫助確定病人是否有貧血。
HLA-B27 抗原測試：如果體內有HLA-B27抗原，表示患此病的可能性增加。不過即使測試呈陽性，亦不一定代表是患上強直性脊椎炎，需配合其他檢驗結果及臨床觀察才能確診。
醫學界普遍採用1984年提出的診斷準則(Modified New York Criteria 1984)作為診斷標準，如果病人出現第4項，加上1至3項其中一項，便可診斷為強直性脊椎炎：
- 下背痛至少3個月，痛楚隨著活動而改善，但休息則無法減輕
- 腰椎向前和轉側的幅度受限制
- 胸部擴展的範圍小於相同年齡和性別的人
- X光檢查發現骶髂關節出現指定程度的病變
由於X光未必能發現早期徵狀，當徵狀顯現時，病人很多時已患病數年，因此近年國際間提出一些新的診斷指引，以幫助診斷早期病人，例如國際強直性脊椎炎評估工作組(ASAS)於2009年提出新指引，病人如符合以下各項便有可能患上強直性脊椎炎：
- 背痛持續3個月
- 發病時為45歲以下
- X光或磁力共振檢查發現有關節炎，並有一項臨床徵狀*；或證實體內有HLA-B27基因，並出現兩項臨床徵狀*
*臨床病徵包括：炎性腰骨痛、關節炎、腳踝接受點病變、虹膜炎、牛皮癬、克隆氏症、對非類固醇抗發炎劑反應良好、有家族病史、C反應蛋白上升等
