[醫療保健] 霍亂弧

膠乳凝集試驗檢測O1群霍亂弧菌

　霍亂是一種烈性腸道傳染病,其早期診斷有利於及時治療和傳染源隔離。本文報導一種快速檢測O1群霍亂弧菌的膠乳凝集試驗(LAT),標本增菌6小時即可進行檢測,LAT操作時間不足5 min。

1　材料和方法

1.1　試劑　抗O1群霍亂弧菌多價單克隆抗體由上海市衛生防疫站提供；羧化聚苯乙烯膠乳(0.8 μm)由上海市臨檢中心提供；SPA-Sepharose 4B購自Sigma公司。

1.2　標本　疑似霍亂糞便標本92例,取自1994年7～9月間就診的腹瀉病人,接種鹼性蛋白腖水37℃增菌6 h後轉種TCBS平板進一步鑑定。所剩鹼性腖水培養物隔水煮沸滅菌,－30℃凍存。臨用前室溫融化,漩渦混勻。陽性對照由上海市普陀區衛生防疫站提供,其菌液濃度為1.3×108 CFU/ml。陰性對照為大腸埃希菌菌落混懸於鹼性蛋白腖水中。107例其它腸道桿菌標本由本科和上海市長寧區中心醫院檢驗科提供。

1.3　單克隆抗體純化　按文獻［1］方法進行。1.5 g SPA-Sepharose 4B用10.0 ml pH 8.0 0.01 mol/L PBS溶脹、裝柱。2.0 ml單克隆抗體用PBS1︰4稀釋後上樣，關緊出水口，4℃2 h。PBS沖洗後用pH 4.0 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩衝液解析。收集解析液中含抗體活性管用pH 9.0 1.0 mol/L Tris-HCl中和，置透析袋中PEG-20000濃縮，pH 7.2 0.02 mol/L PB充分透析，測蛋白濃度。柱用pH 3.0 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩衝液再生。

1.4　免疫膠乳製備　按文獻［2］方法進行。2.5 ml 100 g/L羧化膠乳中加2.5 ml 0.02 mol/L正氨基已酸和5.0 ml pH 7.2 0.2 mol/L PB。加50 mg碳化二亞胺，室溫攪拌1 h，用PB離心洗滌後配成25 g/L濃度。取1.0 ml此膠乳中加入一定量的純化抗體及7.5 mg碳化二亞胺，37℃攪拌2 h。加100 μl pH 8.4 0.1 mol/L甘氨酸緩衝液，30 min後用PB離心洗滌兩次，用含1 g/L NaN3的PB配成10 g/L膠乳懸液，4℃存放。

1.5　膠乳凝集試驗　在黑色玻璃反應板小方格內，各加1滴(約50 μl)增菌6 h的鹼性蛋白腖水和免疫膠乳試劑，輕輕搖動，5 min內觀察結果。出現清晰、均勻一致的凝集顆粒者為陽性，反之為陰性。每次試驗均設陰、陽性對照。

2　結果

2.1　LAT的敏感性　陽性對照用鹼性蛋白腖水倍比稀釋到5×105 CFU/ml時仍出現清晰的凝集顆粒。

2.2　LAT的特異性　107例其它腸道桿菌標本，其中副溶血性弧菌15例，非O1群霍亂弧菌20例，溫和氣單胞菌15例，親水氣單胞菌10例，類志賀鄰單胞菌8例，傷寒沙門菌14例，志賀菌20例(福氏16例，宋內4例)，普通變形桿菌5例。各取一定量的菌落(或菌苔)於鹼性蛋白腖水中製成懸液，進行LAT檢測。結果均為陰性。

2.3　重複性和穩定性　將致敏膠乳保存於4℃冰箱，對5×105 CFU/ml菌液濃度的陽性對照和特異性試驗中的副溶血性弧菌、非O1群霍亂弧菌、溫和氣單胞菌、傷寒沙門菌各10例每兩週測定1次，三個月內共測定6次，結果相同。致敏膠乳一年內對陽性對照測定的敏感性不變。

2.4　與培養法結果的比較　92例臨床標本，培養法陽性44例，均為El-tor生物型小川血清型霍亂弧菌，LAT檢測均陽性；培養法陰性48例，LAT檢測47例陰性，1例陽性。此例LAT檢測時呈大小不一的凝塊，經進一步鑑定為酵母菌。

3　討論

在免疫膠乳製備中，所用單抗與O1群霍亂弧菌菌體抗原A、B、C均可發生反應，因此El-tor弧菌中的三個血清型均可被檢出。但在臨床標本測定中，所檢出的44例均為小川血清型霍亂弧菌，未見稻葉型和彥島型，原因為當年夏秋季的菌株為小川型。在實際應用中，對以下兩種情況要予以重視：一是鹼性腖水表面長有菌膜時要將其充分混勻，吸取菌膜下層液體檢測；否則粘稠的菌膜會影響結果的判斷。二是對陽性標本同時用顯微鏡檢查，若發現有真菌芽生孢子時即可報酵母菌，而不能報告El-tor弧菌。